استخراج DNA خارجکردن و جداسازی داکسیریبونوکلئیکاسید (DNA) از سلولها یا ویروسهایی است که دارای DNA به عنوان ماده ژنتیکی هستند.
DNA استخراج شده برای چه کاری استفاده میشود؟
استخراج DNA غالبا گام اولیه در بسیاری از فرایندهای تشخیصی است که برای تشخیص باکتری و ویروسها در محیط زیست و نیز تشخیص بیماریها و اختلالات ژنتیکی استفاده میشود. این تکنیکها شامل روشهای زیر میشوند:
فلورسانس در حالت هیبریداسیون ( FISH ) : یک روش مولکولی است که اکثرا برای شناسایی و شمارش گروههای باکتری خاص است.
پلیمورفیسم قطعه انتهایی هضمشده ( T-RFLP ) : برای شناسایی، مشخص نمودن و تعیین الگوهای مکانی و زمانی در جوامع باکتری اپیپلانکتون دریایی استفاده میشود.
توالییابی: بخشهایی از ژنوم یا کل آن ممکن است دارای توالی و همچنین عناصر کروموزومی اضافی برای مقایسه با توالی موجود در بانک ژن باشد.
DNA چگونه استخراج میشود؟
مرحله 1. شکستن سلول برای آزاد کردن DNA
سلولهای نمونه از یکدیگر جدا میشوند، اغلب به وسیله یک وسیله فیزیکی مانند ورتکس کردن و در محلول حاوی نمک قرار میگیرند. یونهای سدیم مثبت با نمک در محافظت از گروههای فسفات منفی که در امتداد ستون فقرات DNA قرار دارند شرکت میکنند. سپس مواد شوینده اضافه میشود. مواد شوینده لیپیدها را در غشای سلولی و هسته تجزیه میکند. DNA آزاد شده است چون این غشاها مختل میشوند.
مرحله 2: جداسازی DNA از پروتئینها و سایر باقی ماندههای سلولی
برای به دست آوردن یک نمونه تمیز از DNA، لازم است تا حد زیادی از باقی ماندههای سلولی حذف شود. این کار را میتوان با روشهای مختلف انجام داد. اغلب یک پروتئاز (آنزیم پروتئینی) برای تخریب پروتئینهای مرتبط با DNA و دیگر پروتئینهای سلولی اضافه میشود. به صورت متناوب، برخی از باقیماندههای سلولی را میتوان با فیلتر کردن نمونه حذف کرد.
مرحله 3. رسوب DNA با الکل
در نهایت، الکل یخ زده (یا اتانول یا ایزوپروپانول) به دقت به نمونه DNA اضافه میشود. DNA محلول در آب است، اما در حضور نمک و الکل، نامحلول است. در این مرحله رسوب ظاهر میشود. اگر مقدار زیادی از DNA وجود داشته باشد، ممکن است یک رسوب سفید ببینید.
مرحله 4. تمیز کردن DNA
نمونه DNA اکنون میتواند بیشتر تمیز شود. سپس آن را در یک بافر کمی قلیایی دوباره آماده کرده و آماده استفاده میشود.
مرحله 5. تأیید حضور و کیفیت DNA
برای انجام آزمایشات بیشتر، مهم است که غلظت و کیفیت DNA را بدانید. برای تعیین غلظت و خلوص DNA در یک نمونه، میتوان از خواص چگالی نوری گرفته شده توسط یک اسپکتروفتومتر استفاده کرد. به جای آن، الکتروفورز ژل را میتوان برای نشان دادن حضور DNA در نمونه خود و نشان دادن کیفیت آن به کار برد.
DNA استخراج شده در چه مواردی بررسی میشوند؟
DNA استخراج شده برای تجزیه و تحلیل مولکولی از جمله PCR، الکتروفورز، توالی یابی، اثر انگشت و کلونینگ استفاده میشود.
منابع:
Rohland, N., Glocke, I., Aximu-Petri, A. and Meyer, M., 2018. Extraction of highly degraded DNA from ancient bones, teeth and sediments for high-throughput sequencing. Nature protocols, 13(11), p.2447.
Guevara, E.E., Frankel, D.C., Ranaivonasy, J., Richard, A.F., Ratsirarson, J., Lawler, R.R. and Bradley, B.J., 2018. A simple, economical protocol for DNA extraction and amplification where there is no lab. Conservation genetics resources, 10(1), pp.119-125.
Fiedorova, K., Radvansky, M., Nemcova, E., Grombirikova, H., Bosak, J., Cernochova, M., Lexa, M., Smajs, D. and Freiberger, T., 2019. The impact of DNA extraction methods on stool bacterial and fungal microbiota community recovery. Frontiers in microbiology, 10, p.821.
Zinger, L., Chave, J., Coissac, E., Iribar, A., Louisanna, E., Manzi, S., Schilling, V., Schimann, H., Sommeria-Klein, G. and Taberlet, P., 2016. Extracellular DNA extraction is a fast, cheap and reliable alternative for multi-taxa surveys based on soil DNA. Soil Biology and Biochemistry, 96, pp.16-19.
