روش‌های مختلف الایزا را بشناسیم ( قسمت اول )

Immunometric/Sandwich ELISA :

تست های ایمونومتریک، هم‌چنین به عنوان ELISA ساندویچ شناخته می‌شود و از دو نوع آنتی‌بادی اختصاصی برای آنتی‌ژن استفاده می‌کنند تا آنتی‌ژن‌ها را در چاهک شناسایی کنند. آزمایش‌های ایمونومتری نشان دهنده ارتباط مستقیم بین غلظت آنتی‌ژن و پاسخ سوبسترا است. آنتی‌ژن با آنتی‌بادی دوم که برای آنتی‌ژن اختصاصی است، در یک انکوباسیون دوم قرار می‌گیرد. آنتی‌بادی تشخیصی می‌تواند با یک آنتی‌بادی آنزیمی ثانویه کونژوگه شود. هنگامی که از سوبسترای آنتی‌بادی کونژوگه برای تولید رنگ اضافه می‌شود، نمونه‌هایی با غلظت آنتی‌ژن بالا سیگنال بیشتری نسبت به نمونه با غلظت آنتی‌ژن کم، تولید می‌کنند.تولید سیگنال رنگی متناسب با مقدار غلظت ماده در نمونه است که برای تعیین آن می‌توان از نمودار استاندارد استفاده کرد. کیت‌های ایمونولوژیک بسیار خاص هستند زیرا به یک جفت آنتی‌بادی برای جذب و تشخیص نیاز دارند. آن‌ها هم‌چنین در مقایسه با نمونه‌های پیچیده و بدون نیاز به استخراج نمونه قبل از تجزیه و تحلیل، سازگار هستند.

Competitive ELISA :

در روش رقابتی، آنتی‌ژن نمونه برای اتصال به مکان‌های محدود در آنتی‌بادی با آنزیم نشانگر رقابت می‌کند. این مساله باعث ایجاد رابطه معکوس بین غلظت آنتی‌ژن و جریان سوبسترا می‌شود. الایزا رقابتی معمولا از یک آنتی‌بادی واحد به یک آنتی‌ژن با وزن مولکولی کمتری استفاده می‌کنند، عموما کمتر از 10،000 دالتون. هنگامی که سوبسترای کونژوگه به چاهک اضافه می‌شود، نمونه‌هایی با غلظت آنتی‌ژن بالا یک سیگنال کمتری نسبت به آن‌هایی که حاوی غلظت آنتی‌ژن کم هستند تولید می‌کنند و باعث ایجاد ارتباط معکوس بین غلظت آنتی‌ژن در نمونه و رنگ در آزمایش می‌شود. سپس این رابطه می‌تواند برای استخراج غلظت آنتی‌ژن در یک نمونه ناشناخته از یک منحنی استاندارد استفاده شود. این نوع واکنش یکی از معدود روش‌های ممکن برای آنتی‌ژن‌های با وزن مولکولی کم و با تعداد محدودی از اپی‌توپ‌ها استفاده می‌شود.

منابع:

Zhang, Y., Zhang, Y., Hou, T., Li, R., Xue, Q. and Wang, S., 2019. Homing peptide-based ELISA-like method for the selective and sensitive determination of fibrin. Analytical Methods, 11(7), pp.950-954.

Chen, Y., Liang, Y., Lv, R., Xia, N., Xue, T. and Zhao, S., 2019. An immunological determination of somatostatin in pharmaceutical by sandwich ELISA based on IgY and polyclonal antibody. Microchemical Journal, 145, pp.532-538.

تنظیم تعادل اکسیداسیون ـ احیا تیول برای پروسه­‌های متابولیک، پیام‌­رسانی و رونویسی چندگانه در سلول­‌های پستانداران بسیار مهم است. گروه‌های تیول، چه در پروتئین­‌ها و چه در مولکول­‌های کوچک، بسیار واکنش‌­پذیر و حساس به اکسیداسیون هستند که می‌تواند باعث کاهش قابل توجه فعالیت بیولوژیکی شود. در پروتئین­‌ها، اکسیداسیون گروه­‌های آزاد تیول باعث ایجاد تغییراتی می­‌شود که بسته به موقعیت آن­ها ممکن است بر ساختار، فعالیت کاتالیزوری یا توانایی درگیر شدن در تعاملات پروتئینی تاثیر بگذارد. یک عملکرد حیاتی سیستم­‌های بافری اکسیداسیون احیا تيول بر پایه سلولی، حفاظت از گروه‌­های تيول در مقابل گونه­‌ی فعال اکسيژن و ترمیم آن­‌هاست که ممکن است به علت متابولیسم سلولی طبیعی یا غیر ضروری اکسید شوند. اجزای کلیدی سیستم بافری اکسیداسیون احیا تيول عبارتند از: سیستئین / سیستئین، جفت باز گلوتاتیون(GSH) / گلوتاتیون دی سولفید (GSSG)  و اکسیدوردوکتازهای تیول_دی سولفید که شامل thioredoxin  (Trx)، (Grx) glutaredoxins و پراکسیدوکسین‌­ها (Prx)هستند.

مطالعات زیادی انجام شده­ که توازن بازخوانی GSH را در اختلالات مغزی دخیل می­دانند که موضوع بررسی چندین سال اخیر است؛ یکی از استدلال‌­های قانع‌کننده‌­ای که برای شبکه­‌های نظارتی تیول در بیماری­‌های نوروژنیک تولید می‌­کند، شواهدی از بیان تغییر در بافت­‌های پس از مرگ یا در سلول­‌های سرطانی و پلاسما است. برای این منظور، نمونه­‌های بعد از مرگ متابولیسم از بیماران مبتلا به دیابت بررسی شده­‌است، که در آن مشاهده ­شد که محتوای گلوتاردوکسین در پارکینسون کاهش می‌­یابد، به ویژه در نورون­‌های دوپامینرژیک که بیشتر نقش بازدارندگی در پارکینسون را پشتیبانی می­‌کند. افزایش  S-nitrosylation پروکسی­ردوکسین در مغز انسان مبتلا به پارکینسون، مانع هر دو فعالیت آنزیمی و عملکرد محافظتی آن از استرس اکسیداتیو می‌شود.

پیشرفت­‌های زیادی در درک اهمیت عدم تعادل بازتوانی تیول به عنوان عامل مهمی در بیماری‌های نوروژنیک ایجاد شده است. واکنش پذیری بیولوژیکی اتم گوگرد در سیستئین، به عنوان یک اسید آزاد یا در پروتئین­‌ها و پپتید­ها، عامل مهمی در تعیین حساسیت به آسیب اکسیداتیو، تحریک پذیری و تولید عصبی است. واضح است که بازسازی تعادل اکسیداسیون ـ احیا یک رویکرد مفید برای به حداقل رساندن زیان­‌های عصبی در طول تولید عصب می‌باشد. در بافت مغز پس از مرگ بیماران مبتلا به آلزایمر، بسیاری از رگ­‌های خونی رنگ‌­آمیزی شده پروکسی­ردوکسین را نشان دادند که به علت فرآیندهای آستروستیک است. افزایش گلوتاردوکسین و کاهش ترشح نورونی تیوردوکسین در مغزهای بیماران مبتلا به آلزایمر دیده شده است. علاوه بر این، تغییرات اکسیداتیو در ۲ـ­پروکسی­ردوکسین و ۶ـ­پروکسی­ردوکسین­ در پلاسمای بیماران مبتلا به آلزایمر افزایش یافت.

منابع:

McBean, G.J., Aslan, M., Griffiths, H.R. and Torrão, R.C., 2015. Thiol redox homeostasis in neurodegenerative disease. Redox biology, 5, pp.186-194

Zhang, J., Zhang, Z., Zhang, W., Li, X., Wu, T., Li, T., Cai, M., Yu, Z., Xiang, J. and Cai, D., 2018. Jia-Jian-Di-Huang-Yin-Zi decoction exerts neuroprotective effects on dopaminergic neurons and their microenvironment. Scientific reports, 8.

چگونه منحنی استاندارد رسم کنیم؟ ( قسمت اول )

رسم منحنی استاندارد:

داده‌ها را در یک صفحه گسترده ثبت کنید و  داده‌های به دست آمده را در مقابل هر غلظت قرار دهید. اگر برای هر غلظت حداقل 3 بار تکرار انجام شده است، می‌توان خطاها را از انحراف استاندارد این اندازه‌گیری‌ها برای تخمین خطای هر نقطه محاسبه کرد. برای بررسی، تمام داده‌ها را با استفاده از نرم افزار  به یک رگرسیون خطی منطبق کنید. خروجی خطی باید یک معادله فرمت y = mx + b باشد، جایی که m شیب است و b  عرض از مبدا نمودار را نشان می‌دهد.

در این مرحله می‌توان غلظت نمونه مجهول را با استفاده از نمودار خطی محاسبه کرد. اما نکته در اینجاست که منحنی استاندارد به دست آمده، تنها می‌تواند غلظت‌های به دست آمده در محدوده خط را محاسبه کند. اگر جذب نوری به دست آمده و در نتیجه غلظت نمونه بالاتر از محدوده خط باشد، نمونه نیاز به رقیق سازی دارد که میزان این رقیق‌سازی در انتها تاثیر داده می‌شود .

منحنی استاندارد در بسیاری از زمینه های شیمی تحلیلی، بیوشیمی و شیمی دارویی استفاده می‌شود. رایج‌ترین روش‌استفاده از منحنی استاندارد، استفاده از طیف سنجی، کروماتوگرافی و اندازه‌گیری الکتروشیمیایی است. منحنی استاندارد می‌تواند برای درک غلظت آلودگی محیط زیست در یک نمونه خاک استفاده شود. هم‌چنین استفاده از منحنی استاندارد در تعیین غلظت یک انتقال‌دهنده عصبی در نمونه مایع مغزی، مقدار ویتامین در نمونه‌های دارویی و یا کافئین در غذا بسیار رایج است. بنابراین، منحنی استاندارد در برنامه‌های زیست محیطی، بیولوژیکی، دارویی و علوم غذایی نیز مفید است.

مهم‌ترین بخش رسم منحنی استاندارد، محاسبه دقیق رقت‌های مورد نیاز و رقیق‌سازی صحیح استاندارد‌ است.

منابع:

Carvalho, E. and Hernandes, M.E., 2019. Standard Bases for Fractional Ideals of the Local Ring of an Algebroid Curve. arXiv preprint arXiv:1903.04696

Chen, S., Wu, J.T. and Huang, R., 2012. Evaluation of surrogate matrices for standard curve preparation in tissue bioanalysis. Bioanalysis, 4(21), pp.2579-2587

منحنی استاندارد می‌تواند برای پیش‌بینی غلظت یک نمونه ناشناخته استفاده شود. به طور دقیق، نمونه‌های استاندارد باید در یک روش مشخص همانند نمونه سنجش شوند. تمامی مواد به کار رفته در سنجش و روش کار باید همانند سنجش نمونه‌ها باشد. بسیاری از منحنی‌های استاندارد خطی هستند و می‌توانند با معادله پایه y = mx + b، جایی که m شیب است، و b عرض از مبدا است شناسایی شوند. با این وجود، تمام منحنی‌ها خطی نیستند و گاهی اوقات برای دریافت یک خط، یک یا هر دو مجموعه محورها در یک مقیاس لگاریتمی قرار می‌گیرند. رگرسیون خطی معمولا با استفاده از یک برنامه کامپیوتری انجام می‌شود و رایج‌ترین روش استفاده از حداقل مربعات اتصالات است. هنگامی که منحنی استاندارد خطی است، شیب اندازه‌گیری دارای حساسیت بوده و میزان سیگنال برای تعیین غلظت تغییر می‌کند. یک خط بلندتر با شیب بیشتر نشان دهنده اندازه‌گیری حساس‌تر است. منحنی استاندارد هم‌چنین می‌تواند در تعریف محدوده خطی غلظت‌هایی که دستگاه نشان می‌دهد، کمک کند.

تهیه محلول استاندارد:

به طور معمول، یک ترکیب استاندارد با دقت وزن می‌شود و سپس به صورت کمی به یک بطری حجمی منتقل می‌شود. سپس حلال اضافه شده و بعد از حل کردن ماده استاندارد در آن به حجم می‌رسد. به منظور تهیه رقت‌های سریالی یک فلاسک حجمی دیگر تهیه و مقدار استاندارد مورد نیاز برای رقت مشخص شده به آن اضافه می‌شود، سپس با حلال به حجم می‌رسد. معمولا رقت سازی‌ها 10 برابر انجام می‌شوند به این صورت که به طور مثال هر فلاسک مقدار 1 میلی‌لیتر از استاندارد قبلی در حجم 10 میلی‌لیتر را خواهد داشت. این روند را می‌توان برای تهیه استاندارد با رقت‌های پایین‌تر تکرار کرد. برای یک منحنی استاندارد خوب، حداقل 5 غلظت مورد نیاز است. در آخر جذب نوری غلظت‌های مختلف استاندارد با دستگاه طیف سنج خوانده می‌شود.

خواندن جذب نوری معمولا از پایین‌ترین غلظت شروع شده و تا بیشترین غلظت ادامه‌ می‌یابد. جهت دقت بالاتر و به دست آوردن نمودار استاندارد صحیح، توصیه می‌شود که تهیه استاندارد و هم‌چنین خواندن جذب نوری، 2 بار تکرار شود.

توجه داشته باشید که سنجش نمونه‌ها نیز باید به همان روش سنجش استاندارد انجام شده و محلول‌های مورد استفاده، بافر‌ها و PH مواد یکسان باشد.

چگونه منحنی استاندارد رسم کنیم؟ (‌قسمت دوم )

منابع:

Jakhar, S. and Pundir, C.S., 2018. Preparation, characterization and application of urease nanoparticles for construction of an improved potentiometric urea biosensor. Biosensors and Bioelectronics, 100, pp.242-250.

Green, M.R. and Sambrook, J., 2018. Constructing a standard curve for real-time polymerase chain reaction (PCR) experiments. Cold Spring Harbor Protocols, 2018(10), pp.pdb-prot0950

[vc_row][vc_column][vc_column_text]

نوند سلامت از سال ۹۴ مبنای فعالیت خود را بر تولید کیت آزمایشگاهی تحقیقاتی نهاده است و نهایت تلاش خود را در تامین نیازهای پژوهشگران انجام می‌دهد. پیش از نوند سلامت، کیت‌های آزمایشگاهی آنتی اکسیدانتی بصورت وارداتی برای استفاده محققین این حوزه مورد استفاده قرار می‌گرفت. اما سوالی که ممکن است برای اساتید و دانشجویان ایجاد شود این است که چرا در انتخاب میان کیت‌های آزمایشگاهی وارداتی و تولید نوند سلامت، انتخاب نوند سلامت انتخابی بهتر و مطمئن‌تر است؟

در این نوشته به بررسی پاسخ سوال فوق پرداخته‌ایم:

[/vc_column_text][us_separator][us_image image=”7333″ size=”full”][vc_column_text]زمان تحویل
برای تهیه کیت‌های وارداتی می‌بایست ۳۰ الی ۶۰ روز منتظر بمانید. کیت‌های نوند سلامت در کمتر از یک‌هفته در دسترس شما هستند.[/vc_column_text][us_separator][us_image image=”7335″ size=”full”][vc_column_text]قیمت مناسب
کیت‌های تولیدی نوند سلامت در مقایسه با نمونه‌های مشابه خارجی و وارداتی تا ۸۳ درصد قیمت کم‌تری دارند.[/vc_column_text][us_separator][us_image image=”7334″ size=”full”][vc_column_text]ارسال رایگان
از نیمه دوم اردیبهشت‌ ماه ۹۶ ارسال کیت‌های آزمایشگاهی نوند سلامت به تمامی مراکز استان‌ها بصورت رایگان صورت می‌گیرد[/vc_column_text][us_separator][us_image image=”7337″ size=”full”][vc_column_text]پشتیبانی و خدمات پس از فروش
کارشناسان پشتیبانی و تجربه آزمایشگاهی ما همواره آماده پاسخگویی شما پژوهشگران هستند تا آزمایش‌هایی دقیق، مطمئن و تکرارپذیر اجرا کنید[/vc_column_text][us_separator][us_image image=”7336″ size=”full”][vc_column_text]دقت و کیفیت
تمامی مواد اولیه کیت‌های نوند سلامت از بهترین تولیدکنندگان و به همراه آنالیزهای لازم تهیه شده و کیت‌ها قبل از ارسال از تست‌های کنترل کیفی عبور می‌کنند[/vc_column_text][us_separator][cl-review quote=”ما در نوند سلامت همواره در حال برنامه‌ریزی و اجرای برترین روش‌ها در جهت ایجاد بهترین تجربه آزمایشگاهی برای شما پیشتازان علم در حوزه علوم زیستی و پزشکی هستیم

” author=”” occupation=”” type=”quote” layout=”clean” italic=”1″][/vc_column][vc_column][/vc_column][/vc_row]

مطالعات اخیر نشان می‌دهد که فلور میکروبی روده باعث تنظیم متابولیسم آنتی‌اکسیدانت گلوتاتیون و آمینو اسید در میزبان می‌شود. گلوتاتیون یک آنتی‌اکسیدانت کلیدی است که در تمامی سلول‌های بدن یافت می‌شود. کمبود گلوتاتیون باعث استرس اکسیداتیو می‌شود که نقش مهمی در بسیاری از بیماری‌های مرتبط با سبک زندگی دارد.

خروجی عملکردی و تنوع فلور میکروبی روده تنظیم‌کنندگان مهمی در بروز بیماری‌های مختلف انسان هستند.  چاقی، دیابت نوع ۲، آترواسکلروز، کبد چرب غیر الکی و سوء تغذیه از جمله این بیماری‌ها هستند. بنابراین واکنش بین فلور میکروبی روده، بافت‌ روده میزبان و سایر بافت‌های بدن با سلامت میزبان بسیار مرتبطند.

در مقاله‌ای که در نشریه Molecular Systems Biology توسط تیمی از دانشگاه‌های صنعتی چالمرز، انستیتو سلطنتی تکنولوژی و دانشگاه گوتنبرگ سوئد چاپ شده، عنوان شده است که فلور میکروبی روده باعث تنظیم متابولیسم گلوتاتیون و آمینو اسید در میزبان می‌شود.

گلوتاتیون قوی‌ترین آنتی‌اکسیدانت بدن و اصلی‌ترین ماده سم‌زدای (Detoxifying agent) بدن است. این ماده در سیستم ایمنی بدن، متابولیسم مواد غذایی و تنظیم سایر رخدادهای سلولی، نقش بسیار حیاتی دارد. گلوتاتیون پروتئین کوچکی است و در داخل سلول از ۳ آمینو اسید که بطور مداوم از طریق تغذیه وارد بدن می‌شوند، ساخته می‌شود. کمبود گلوتاتیون باعث بروز استرس اکسیداتیو می‌شود. همانطور که اشاره شد، استرس اکسیداتیو نقش بسیار مهمی در بیماری‌های متابولیک دارد.

در این مطالعه، نقشه‌ای کلی از متابولیسم موش طراحی شد و مدل‌های رایانه‌ای ویژه‌ای برای  هر بافت ایجاد گردید. به‌وسیله استفاده از داده‌های تجربی High throughput، محققین دریافتند که فلور میکروبی در روده گلایسین مصرف می‌کند. گلایسین یکی از ۳ آمینو اسیدی است که برای ساخت گلوتاتیون در بدن مورد نیاز است.

برای تایید نتایج به‌دست آمده از طریق شبیه‌سازی‌های مبتنی بر رایانه، سطوح آمینو اسید گلایسین در ورید پرتال کبدی موش اندازی‌گیری شد. علاوه‌براین سطوح پایین‌تری از گلایسین در بافت کبد و کولون یافت شد که نشان‌گر تنظیم متابولیسم گلوتاتیون نه تنها در روده کوچک، بلکه در کبد و کولون توسط فلور میکروبی روده است.

عادل ماردین اولو نویسنده مسئول این مقاله از دانشگاه چالمرز می‌گوید:”برخی از باکتری‌های روده گلایسین مصرف می‌کنند و عدم وجود تعادل در ترکیب باکتری‌های روده باعث ایجاد بیماری‌های مزمن می‌شود” در مطالعات مستقل قبلی نیز سطوح نامتعادل گلایسین و سایر آمینو اسیدهای پلاسما در بیماری‌های چاقی، دیابت نوع ۲ و کبد چرب غیر الکلی گزارش شده است.

این اکتشاف ممکن است به توسعه محصولات غذایی منجر شود که باکتری‌های مفید (پروبیوتیک‌ها) را به بدن انتقال دهند. نتایج این مطالعه به ما کمک می‌کند تا نقش باکتری‌ها در ایجاد و توسعه بیماری‌های متابولیکی چون دیابت نوع ۲، چاقی، کبد چرب غیر الکلی و سوء تغذیه چگونه است.

منبع:

Mardinoglu, A., Shoaie, S., Bergentall, M., Ghaffari, P., Zhang, C., Larsson, E., Bäckhed, F. and Nielsen, J., 2015. The gut microbiota modulates host amino acid and glutathione metabolism in mice. Molecular systems biology, 11(10), p.834.